CODE : CM0607

500 grammes permettent de préparer 22 litres de milieu double concentration ou 44,1 litres de milieu simple concentration.

PREPARATION
Double concentration :
Dissoudre 5 g de chlorure d’ammonium dans un litre d’eau distillée. Ajouter 22,7 g de milieu de base au glutamate modifié CM0607 et 12,7 g de glutamate de sodium LP0124. Mélanger pour dissoudre complètement. Stériliser 10 minutes à 116°C à l’autoclave ou chauffer 30 minutes à 100°C, 3 jours de suite.
Simple concentration :
Dissoudre 2,5 g de chlorure d’ammonium dans un litre d’eau distillée. Ajouter 11,3 g de milieu de base au glutamate modifié CM0607 et 6,4 g de glutamate de sodium LP0124. Mélanger pour dissoudre complètement. Stériliser 10 minutes à 116°C à l’autoclave ou chauffer 30 minutes à 100°C, 3 jours de suite.
Remarque :
Pour augmenter la stabilité du milieu déshydraté lors de sa conservation, le glutamate de sodium LP0124 est fourni séparément et doit être ajouté au milieu de base CM0607.
Pour une efficacité optimale, le pH du milieu final doit être ajusté, si nécessaire, à 6,7 avant utilisation.
Selon les procédés de chauffage, le pH final peut varier. Si nécessaire, adapter le procédé de chauffage pour obtenir un pH final de 6,7 après stérilisation¹.

DESCRIPTION
Un milieu de composition chimique précise basé sur l’acide glutamique a été initialement préconisé par Folpmers ² pour la numération des coliformes dans les eaux.
Le Public Health Laboratory Service ³ a fait des essais et a conclu que les milieux à l’acide glutamique contenant du glucose donnaient trop de réactions faussement positives en 48 heures. Gray ⁴ a modifié le milieu au glutamate avec du lactose et a ensuite publié une formule améliorée du milieu au glutamate avec formiate et lactose.⁵
Ce dernier milieu a fait l’objet d’essais nombreux menés par le PHLS ⁶ qui a comparé 3 milieux au glutamate avec le bouillon Teepol (Jameson et Emberly⁷) et avec le bouillon de Mac Conkey. Les résultats ont montré la supériorité de la formule améliorée de Gray par rapport aux autres milieux au glutamate testés.
Le rapport critiquait la composition minérale du milieu mais considérait qu’il était possible de l’améliorer en modifiant les quantités de ses composés minéraux.
Ce milieu OXOID a ensuite été utilisé par le PHLS6 dans d’autres études qui ont confirmé la supériorité des milieux au glutamate comme cela avait été signalé auparavant (PHLS⁶).
Cette supériorité du milieu au glutamate modifié sur le bouillon de Mac Conkey est essentiellement due à un meilleur isolement de Escherichia coli.
Le tableau ci-après (adapté du PHLS⁸) rend compte des résultats obtenus lors de cette étude.
Il montre que pour l’eau chlorée il faut incuber plus de 18 heures les milieux au glutamate pour prouver leur supériorité.
Le milieu utilisé et la méthode employée sont décrits avec précision dans le “Her Majesty’s Stationery Office Report” 71.¹
Plus récemment, des essais ont montré que le milieu au glutamate modifié était le meilleur pour la recherche d’Escherichia coli dans les eaux chlorées, surtout lorsque le nombre de ces germes est peu élevé dans l’échantillon.
Ce milieu a aussi été trouvé meilleur que le bouillon Lauryl Tryptose Lactose pour rechercher un faible nombre d’Escherichia coli dans d’autres eaux, bien que ce dernier milieu ait donné des résultats plus rapides (en 18 à 24 heures au lieu des 48 heures nécessaires avec le milieu au glutamate modifié).
Papadakis¹⁰ a essayé d’isoler E. coli dans l’eau de mer et a trouvé le milieu au glutamate modifié meilleur que les divers bouillons de Mac Conkey. Cependant, afin d’éviter une trop forte concentration de sel dans le bouillon, il recommande d’ajouter seulement 1 ml d’eau de mer dans 10 ml de milieu à simple concentration. Pour des volumes plus importants d’eau de mer, faire des dilutions supérieures.

UTILISATION
La technique du nombre le plus probable (NPP) est utilisée avec le milieu au glutamate modifié. Une étude comparant la méthode par filtration sur membrane avec celle du NPP a montré pour la première l’inefficacité du milieu au glutamate modifié pour la recherche des coliformes présents dans l’eau.¹¹
Pour les eaux de bonne qualité, ensemencer le milieu avec 50 ml d’échantillon et 5 fois 10 ml. Avec les eaux plus contaminées, ensemencer en plus 5 fois 1 ml. Pour une eau fortement polluée, utiliser des dilutions de 1 ml et ne pas faire l’essai avec les 50 ml.
Les grands volumes d’eau (10 ml et 50 ml) sont ajoutés à un égal volume de milieu à double concentration. Ceux de 1 ml (ou les dilutions) sont ajoutés à 5 ml de milieu à simple concentration.
Incuber les tubes à 37°C et observer après 18 à 24 heures. Les tubes présentant une couleur jaune (acidification) et du gaz dans les cloches de Durham doivent faire supposer la présence d’E. coli même si le gaz apparaît après avoir tapoté le tube. Les autres tubes sont réincubés 24 heures et ceux qui deviennent positifs seront traités comme les précédents.
Chaque tube apparemment positif doit être repiqué en bouillon bilié au vert brillant à 2 % (CM0031) et incubé 24 heures à 44°C.
Parallèlement, ensemencer un tube d’eau peptonée à 1 % (CM0087) pour tester la production d’indole après 24 heures à 44°C.
La formation de gaz à partir du lactose à 44°C et la production d’indole confirment la présence d’Escherichia coli.
Les échantillons d’eau chlorée donnant une réponse présumée positive doivent être vérifiés pour éliminer les réactions faussement positives dues aux germes (anaérobies ou aérobies) sporulés et qui produisent du gaz. Repiquer sur bouillon bilié au vert brillant à 2 % et incuber 48 heures à 37°C. Une production de gaz en moins de 48 heures suffit à confirmer la présence de coliformes. Si on repique les tubes parallèlement sur gélose de Mac Conkey (CM0007), on obtient des colonies caractéristiques, utilisées ensuite pour les tests de différenciation.
Une étude multicentrique ultérieure a démontré l’efficacité du bouillon Lauryl Tryptose Mannitol comme seul test de confirmation d’Escherichia coli.¹²
Le nombre le plus probable de germes peut être calculé d’après les tables de l’appendice C du rapport 71 de l’HMSO.
Méthode modifiée de numération directe d’E. coli dans les aliments :
La méthode directe sur boîte pour la numération rapide d’E. coli dans les aliments a été décrite¹³, et modifiée par une procédure de revitalisation qui utilise le milieu au glutamate modifié.¹⁴ Pour cela, ajouter 15 g/l d’agar dans le bouillon OXOID CM0607 + LP0124. Les auteurs ont ainsi récupéré des germes stressés par la congélation, la dessication, le chauffage ou l’abaissement du pH dans les aliments.
Abbiss et coll.¹⁵ ont fait une étude comparative des performances du milieu au glutamate modifié avec celles de 3 autres bouillons enrichis pour la numération des coliformes présents dans les fromages à pâte molle, les plats cuisinés et les pâtes. Le milieu au glutamate modifié était plus sensible que le bouillon Lauryl Sulfate Tryptose, le bouillon de Mac Conkey et le bouillon bilié au vert brillant.

Comparaison du milieu au glutamate modifié et du bouillon de Mac Conkey par la technique du NPP :

NOMBRE DE TUBES TESTES

CONSERVATION
Conserver le milieu déshydraté à 10–25°C jusqu’à la date de péremption indiquée sur le flacon.
Conserver le milieu prêt à l’emploi à 2–8°C.

CONTROLE DE QUALITE
Contrôle positif :
Escherichia coli (acide + gaz) ATCC® 25922
Contrôle négatif :
Enterobacter aerogenes (acide seulement) ATCC® 13048

BIBLIOGRAPHIE
1 Departments of the Environment, Health & Social Security and PHLS (1982), The Bacteriological Examination of Drinking Water Supplies, Report on Public Health and Medical Subjects No 71, HMSO, London.
2 Folpmers T. (1948) Ant. v. Leeuwenhoek, J. Microbiol. Serol., 14, 58-64.
3 PHLS Water Sub-Committee (1958), J. Hyg Camb., 56, 377-388.
4 Gray R.D. (1959), J. Hyg. Camb., 57, 249-265.
5 Gray R.D. (1964), J. Hyg. Camb., 62, 495-508.
6 PHLS Standing Committee on Bacteriological Examination of Water Supplies (1968), J. Hyg. Camb., 66, 67-82.
7 Jameson J.E. and Emberly N.W. (1956), J. Gen. Microbiol., 15, 198-204.
8 PHLS Standing Committee on the Bacteriological Examination of Water Supplies (1969), J. Hyg. Camb., 67, 367-374.
9 Joint Committee of the PHLS and Standing Committee of Analysts (1980), J. Hyg. Camb., 85, 35-48.
10 Papadakis J.A. (1982) 6th Workshop on Marine Pollution of the Mediterranean, Cannes.
11 PHLS Standing Committee on the Bacteriological Examination of Water Supplies (1972), J. Hyg. Camb., 70, 691-705.
12 Joint Committee of the PHLS and Standing Committee of Analysts (1980), J. Hyg. Camb., 15, 51-57.
13 Anderson J.M. and Baird-Parker A.C. (1975), J. Appl. Bact., 39, 111-117.
14 Holbrook R., Anderson J.M. and Baird-Parker A.C. (1980), Food Technology in Australia, 32, 78-83.
15 Abbiss J.S., Wilson J.M., Blood R.M. and Jarvis B. (1981), J. Appl. Bact., 51, 121-127