MILIEU DE BASE CYE

CODE : CM0655

500 grammes permettent de préparer 20,0 litres de milieu.

SUPPLEMENT DE CROISSANCE BCYE a

CODE : SR0110

SUPPLEMENT DE CROISSANCE BCYE a sans L-cystéine

CODE : SR0175

SUPPLEMENT DE CROISSANCE BMPA a

CODE : SR0111

SUPPLEMENT DE CROISSANCE MWY

CODE : SR0118

SUPPLEMENT SELECTIF GVPC

CODE : SR0152

PREPARATION
1 Milieu BCYE
Verser 2,5 g de poudre de base CYE (CM0655) dans 90 ml d’eau distillée. Porter doucement à ébullition jusqu’à dissolution complète. Stériliser 15 minutes à 121°C à l’autoclave. Refroidir à 50°C et ajouter stérilement le contenu d’un flacon de supplément de croissance BCYE ? (SR0110A) reconstitué avec 10 ml d’eau distillée stérile. Bien mélanger et répartir. pH final : 6,9 ± 0,1.
2 Milieu BCYE sans L-cystéine
Verser 2,5 g de poudre de base CYE (CM0655) dans 90 ml d’eau distillée. Porter doucement à ébullition jusqu’à dissolution complète. Stériliser 15 minutes à 121°C à l’autoclave. Refroidir à 50°C et ajouter stérilement le contenu d’un flacon de supplément de croissance BCYE sans L-cystéine (SR0175) reconstitué avec 10 ml d’eau distillée stérile. Bien mélanger et répartir. pH final : 6,9 ± 0,1.
3 Milieux sélectifs BMPA a et MWY
Dissoudre 2,5 g de milieu de base CYE dans 90 ml d’eau distillée. Porter doucement à ébullition jusqu’à dissolution complète. Stériliser 15 minutes à 121° C à l’autoclave. Refroidir à 50° C et ajouter stérilement le contenu d’un flacon de supplément de croissance BCYE a (SR0110A) reconstitué avec 10 ml d’eau distillée stérile et un flacon de supplément sélectif BMPA a (SR0111E) ou MWY (SR0118E) reconstitué par 2 ml d’eau distillée stérile. Mélanger et répartir. Le pH final des deux milieux sera 6,9 ± 0,1.
4 Milieu sélectif GVPC
Verser 12,5 g de poudre de base (CM0655) dans 450 ml d’eau distillée. Porter doucement à ébullition jusqu’à dissolution complète. Stériliser 15 minutes à 121°C à l’autoclave. Refroidir à 50°C et ajouter stérilement le contenu d’1 flacon de supplément de croissance BCYE a (SR0110A) reconstitué par 10 ml d’eau distillée stérile et un flacon de supplément sélectif GVPC (SR0152) repris par 10 ml d’eau distillée stérile. Mélanger et répartir. pH final : 6,9 ± 0,1.

DESCRIPTION
La découverte de l’agent étiologique de la maladie des Légionnaires est due à Fallon.¹ Depuis, de nombreux progrès ont été réalisés dans la culture de ce microorganisme à partir d’échantillons cliniques ainsi que pour la numération des Legionella à partir d’échantillons de l’environnement.
La recherche de Legionella dans les échantillons d’eau a souvent été réalisée par immunofluorescence. ² Cependant, la technique par isolement reste la plus utilisée. Elle présente un intérêt tout particulier dans les études épidémiologiques.
Feeley et coll.³ ont décrit une modification de la gélose F-G ⁴ dans laquelle l’hydrolysat acide de caséine était remplacé par l’extrait de levure comme source de protéines et l’amidon était remplacé par du charbon activé (Norit A) à une concentration finale de 0,2 % (pds/vol). Ce milieu dénommé gélose CYE³ a été ensuite supplémenté avec le tampon ACES et de l’?-cétoglutarate ; il est décrit dans la littérature comme le milieu BCYE a.⁵
Le milieu BCYE a a montré sa capacité de récupération des Legionella avec une période d’incubation plus courte à partir d’échantillons cliniques et de l’environnement.⁶ Le milieu BCYE a OXOID est basé sur la formule d’Edelstein.⁵ Il est préparé à partir de la gélose de base CM0655 additionnée du supplément de croissance SR0110. Ce supplément de croissance permet, grâce au tampon ACES, de stabiliser le pH à 6,9 ± 0,1, tandis que le pyrophosphate de fer et le chlorhydrate de cystéine constituent les facteurs de croissance indispensables.
Le milieu BCYE a peut être rendu sélectif par l’addition de glycocolle⁶ et d’agents^5,8 antimicrobiens.
Les milieux suivants ont été décrits :
1 Milieu BMPA a: Ce milieu semi-sélectif est recommandé par Edelstein ⁵ pour l’isolement de L. pneumophila à partir d’échantillons cliniques contaminés et d’échantillons de l’environnement. Ce milieu peut être préparé en ajoutant à la gélose de base BCYE a le supplément sélectif BMPA a (SR0111).
2 Milieu MWY (WADOWSKY and YEE medium⁸ modified by Edelstein) : Par sa composition, ce milieu permet une coloration des colonies et aide à l’identification des microorganismes.^8,10 Edelstein¹¹ considère ce milieu comme étant le meilleur pour l’isolement de L. pneumophila à partir d’échantillons d’eau potable. Ce milieu peut être préparé par addition du supplément MWY (SR0118) à la gélose de base BCYE a.
3 Milieu GVPC : Ce milieu sélectif est recommandé pour l’isolement des Legionella sp. à partir d’échantillons d’eau et de l’environnement. Le supplément GVPC est basé sur la formule décrite par Denis et al.4 Le cycloheximide a été incorporé du fait de sa plus grande activité sélective vis-à-vis des champignons par rapport à l’anisomycine qui est presque exclusivement active contre les levures. Cette formule apparaît dans le projet du BSI (British Standard Institut) concernant la détection et la numération des Legionella dans les eaux.⁵
La vancomycine et la polymyxine inhibent la croissance des bactéries Gram – et la plupart des Gram +.
Les échantillons de l’environnement doivent être prétraités avec un tampon acide (pH 2,2).⁷ L’échantillon doit être ensemencé avant et après traitement pour augmenter le pourcentage de récupération (voir technique).
Il est à noter que le milieu MWY est plus sélectif que le milieu BMPA a.

UTILISATION
Echantillons cliniques :
L’isolement des Legionella est souvent réalisé avec succès à partir d’une biopsie pulmonaire ou d’une aspiration bronchique.
1 Homogénéiser l’échantillon dans l’eau distillée stérile.
2 Rechercher les Legionella par immunofluorescence et les autres bactéries par une coloration de Gram.
3 Ensemencer les échantillons ne contenant que des Legionella sur milieu non sélectif BCYE a.
Les échantillons positifs ou négatifs en fluorescence, présentant une flore mixte, seront ensemencés sur milieu sélectif BMPA a.
4 Incuber à 37°C dans une atmosphère à 90 % d’humidité.
5 Les colonies apparaissent habituellement en 2–3 jours, mais continuer à observer les boîtes pendant 14 jours, avant de les éliminer.
Echantillons de l’environnement :
Pour chaque échantillon, trois boîtes doivent être ensemencées : une, après traitement de l’échantillon à la chaleur ; une après traitement de l’échantillon à l’acide et une avec un échantillon n’ayant subi aucun traitement.
Prétraitement à la chaleur :
Mettre 10 ml d’échantillon concentré dans un bain-marie à 50°C pendant 30 minutes.
Prétraitement à l’acide :
1 Mettre 10 ml d’échantillon concentré dans un sachet scellé et centrifuger à 2 500 tours/min pendant 20 minutes.
2 Décanter le surnageant pour laisser environ 1 ml de liquide.
3 Ajouter 9 ml de tampon HCl-KCl (voir ci-dessous) et agiter doucement 5 minutes.

Sans prétraitement :
Mettre 10 ml d’échantillon concentré.
Etaler 0,1 ml de chaque échantillon décrit ci-dessus sur une boîte de l’un des milieux sélectifs à l’aide d’une oese stérile.
Incuber à 36°C ± 1°C et examiner les boîtes tous les jours pendant 7 jours.
Faire une subculture des colonies suspectes sur gélose Tryptone Soja contenant 5 % de sang de mouton et sur milieu BCYE a.
Les colonies poussant sur milieu BCYE a et non sur gélose Tryptone Soja et ayant un aspect caractéristique, sont identifiées de façon présomptive comme étant des Legionella. Des tests biochimiques et immunologiques confirmeront leur présence.¹⁴
Etant donné que les milieux décrits ne sont pas complètement sélectifs pour les Legionella sp., il est recommandé8 d’examiner les boîtes selon les critères suivants :
1 Les colonies observées à la loupe binoculaire, doivent avoir une couleur et un aspect typiques.
2 Les colonies isolées ne doivent pas pousser sur gélose au sang.
3 Les microorganismes doivent être Gram –.
Les Legionella sp. ne peuvent pas être identifiées seulement par leurs caractéristiques de croissance sur milieux variés ou par des tests biochimiques. Il faut effectuer des tests supplémentaires : homologie de l’ADN, sérotypage (et acides gras cellulaires).

LECTURE (après 2 à 3 jours d’incubation à 37°C) :
L. pneumophila : colonies blanches, brillantes, rondes, lisses et bombées, de 1 à 2 mm de diamètre (qui augmente lors d’une incubation plus longue).
L. gormanii : colonies blanches ou crème, légèrement bombées et muqueuses, de 1 à 2 mm de diamètre.
Autres Legionella (L. micdadei, L. bozenanii, L. dumofii, L. longbeachae et L. jordanis) : même aspect que L. pneumophila.
Coloration de Gram sur primo-isolement :
Bacilles pléomorphiques, courts, de 1 µm de large sur 1 à 4 µm de long ; Gram –.
Utiliser de la carbol-fuchsine pour contre-colorer les Legionella car celles-ci ne prennent pas la safranine et la fuchsine basique.

CONSERVATION
Conserver le milieu déshydraté à 10–25°C jusqu’à la date de péremption indiquée sur le flacon.
Conserver les boîtes prêtes à l’emploi à 2–8°C à l’obscurité, 15 jours maximum.

CONTROLE DE QUALITE
Lorsque l’on teste les performances des milieux avec des cultures de Legionella, il est préférable d’utiliser des souches “sauvages” car les Legionella ont la faculté de s’adapter à certaines conditions de croissance qui ne permettraient pas le primo isolement de ces mêmes souches. On entend par “souches sauvages” des germes qui n’ont pas été repiqués plus de deux fois.
Le milieu GVPC ne doit pas être testé avec une souche de L. pneumophila isolée à partir de l’air climatisé du laboratoire concerné.
Contrôle positif :
Legionella pneumophila ATCC® 33152
Contrôle négatif :
E. coli ATCC® 25922
S. epidermidis ATCC® 12228

PRECAUTIONS
Les Legionella sont très pathogènes par inhalation. Eviter les aérosols et maintenir les suspensions cellulaires à l’abri. Décontaminer les paillasses avec de l’hypochlorite à 5 %. Stériliser tout le matériel avant élimination.
Incuber les cultures à 37°C dans une atmosphère à 65 % d’humidité pendant 10 jours.
Le milieu BCYE a ne nécessite pas de CO2 mais, pour les autres milieux et les échantillons d’eau^7,15, il est recommandé d’incuber avec 2,5 % de CO2.
Les germes poussant sur gélose au sang comme sur milieux pour Legionella ne sont pas des Legionella.
Certains germes thermophiles et sporulés donnent des colonies qui ressemblent à celles des Legionella lors d’une incubation à 37°C. Ces microorganismes sont détectés en faisant 2 incubations : à 35°C et à 55°C ; ils pousseront aux deux températures tandis que les Legionella ne poussent pas au dessus de 45°C.

BIBLIOGRAPHIE
1 Fallon J., Oxoid Limited. Culture September 1979, p. 3-4.
2 Fliermans C.B. et al. (1981) Appl. Environ. Microbiol.,41, 9-16.
3 Feeley J.C., Gibson R.J., Gorman G.W., Langford N.C., Rasheed J.W., Mackel D.C. and Baine W.B. (1979) J. Clin. Micro., 10. 437-441.
4 Feeley J.C., Gorman G.W., Weaver R.E., Mackel D.C. and Smith H.W. (1978) J. Clin. Micro., 8. 320-325.
5 Edelstein P.H. (1981) J.Clin. Micro., 14. 298-303.
6 PHLS Communicable Diseases Report (1983) CDR 83/49.
7 Bopp C.A., Sumner
8 Vickers R.M., Brown A. and Garrity G.M. (1981) J. Clin. Micro., 13. 380-382.
9 Wadowsky R.M. and Yee R.B. (1981) Appl. and Environ.Microbiol., 42. 768-772.
10 Renner E.D. and Tseng C.H. (1982) Clin. Microbiol. Newsletter, 4. 139-142.
11 Edelstein P.H. (1982) J. Clin. Micro., 16. 697-699.
12 Dennis P.J.L., Bartlett C.L.R. and Wright A.E. (1984) Comparison of isolation methods for Legionella sp. In Thornsbury, C. et al (eds) Legionella : Proceedings of the 2nd International Symposium Washington D.C. Am. Soc. Microbiol., pp 294-296.
13 BSI Documents Determination of Legionellae in water and related materials. Method for their detection and enumeration. July 1989 DRAFT DOCUMENT. 89/53406.
14 Vesey G., Dennis P.J., Lee J.V. and West A.A. (1988)  J. Appl. Bact., 65. 339-345.
15 Edelstein P.H. and Finegold S.M. (1979) J. Clin.Microbiol., 10. 141-143.