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STAPHLOCOCCAL 12S IDENTIFICATION SYSTEM
CODE: MB1561
Introduction
Les staphylocoques restent un élément important de la flore commensale humaine,
les staphylocoques produisant une réaction coagulase négative en représentant
le plus
grand pourcentage 1. Bien qu'ils soient des contaminants fréquents, les staphylocoques sont devenus
des germes nosocomiaux importants, en partie en raison de l'usage accru d'appareils médicaux à
demeure. Etant maintenant devenus aussi importants, il est crucial que les laboratoires de microbiologie puissent
identifier chaque espèce de staphylocoques qui produisent une réaction coagulase négative 2.
Usage Prevu
Le système Microbact™ Staph 12S repose
sur les systèmes d'identification classiques 3,10. Grâce à l'usage associé de sucres et de substrats enzymatiques colorimétriques,
le 12S est
en mesure d'identifier 22 des espèces cliniques de staphylocoques les
plus importantes 2, y compris celles
qui produisent des réactions coagulase négative et coagulase positive.
Le
système Microbact™ Staph 12S est conçu pour identifier
uniquement les espèces Staphylococcus . Les staphylocoques sont
des cocci Gram positif
(de 0,5 à 1,5 mm de diamètre) ; ce sont des anaérobies facultatifs immobiles non sporulés et
qui produisent une réaction catalase positive.
Micrococcus et
les genres associés peuvent être éliminés car ils ne peuvent pas proliférer
en anaérobiose et résister au furazolidone (disque de 100 mg) 5.
Principe Du Test
Le système Microbact™ Staph 12S est un système de microsubstrats normalisé conçu pour imiter les substrats biochimiques
classiques dont on se sert pour identifier les espèces Staphylococcus. Chaque bandelette d’identification
comporte 12 tests. Les réactions qui se produisent durant la période d’incubation sont mises en évidence par
un changement de couleur qu’il est facile d’interpréter. Les tests avec utilisation de sucres comptent sur un
changement de couleur d’un indicateur de pH, alors que les substrats d’identification enzymatiques produisent un
produit terminal coloré ou réagissent avec un indicateur ajouté.
L’identification des bactéries repose sur le changement du pH et l’utilisation de substrats, tel qu’il est établi dans
les références publiées 3,4,6,7,8,9. Se référer à la table des substrats/réactions de la page 2 qui indique les principes
réactionnels et les changements de couleur spécifiques.
Chaque
espèce de Staphylococcus produit un modèle différent de réactions. Quand les résultats des réactions sont
entrés dans le progiciel Microbact™ en utilisant un code numérique, une identification probable de l’espèce de
Staphylococcus en question est produite. Oxoid agrandit et améliore constamment sa base de données de réactions
indépendante à utiliser avec le système Microbact™ Staph 12S.
TABLE DES SUBSTRATS ET DES REACTIONS:
Cupule No. |
Désignation |
Principe de la réactio |
Réaction |
Commentaires |
Négative |
Positive |
1 |
Maltose |
Utilisation de sucres spécifiques résultant en la production de produits terminaux acides |
Rouge |
Jaune |
L’indicateur au rouge de phénol change de couleur quand on utilise le sucre approprié produisant de l’acide |
2 |
Mannitol |
Rouge |
Jaune |
3 |
Mannose |
Rouge |
Jaune |
4 |
Sucrose |
Rouge |
Jaune |
5 |
Tréhalose |
Rouge |
Jaune |
6 |
N-acétyl glucosamine |
Rouge |
Jaune |
7 |
Utilisation d’arginine |
Détection de l’arginine dihydrolase après 24 heures |
Jaune/vert olive |
Vert/bleu |
L’arginine dihydrolase convertit l’arginine en ornithine, ammoniaque et anhydride carbonique.
L’augmentation du pH est indiquée par le bleu de bromothymol. Les réactions donnant une couleur verte et se
produisant après 48 heures doivent être interprétées comme négatives. |
8 |
Test de l’uréase |
Hydrolyse de l’urée |
Paille/jaune |
Rose/rouge |
L’uréase fractionne l’urée en anhydride carbonique et en ammoniaque. L’augmentation du pH est indiquée par le rouge de phénol. |
9 |
Bêta-glucosidase |
Hydrolyse du p-nitrophenyl- ß-D-glucopyranoside par l’action de la ß-glucosidase |
Jaune pâle/incolore |
Jaune vif |
L’hydrolyse du p-nitrophényl- ß-d-glucopyranoside incolore libère du p-nitrophénol jaune. |
10 |
Alkaline phosphatase |
Hydrolyse du p-nitrophényl-phosphate par action de l’alcaline phosphatase |
Jaune pâle/incolore |
Jaune vif |
L’hydrolyse du p-nitrophényl-phosphate incolore libère du p-nitrophénol jaune |
11 |
Bêta-glucuronidase |
Hydrolyse du p-nitrophényl-ß-D-glucuronide par action de la ß-glucuronidase |
Jaune pâle/incolore |
Jaune vif |
L’hydrolyse du p-nitrophényl- ß-d-glucuronide incolore libère du p-nitrophénol jaune |
12 |
Bêta-galactosidase |
Hydrolyse du p-nitrophényl-ß-D-glucuronide par action de la ß-glucuronidase |
Jaune pâle/incolore |
Mauve prune |
L’hydrolyse du ß-naphtyl- ß-d-galactopyranoside incolore libère du ß-naphtol qui est détecté par le sel BB bleu acide qui vire au mauve |
LE SYSTEME MICROBACT™ STAPH 12S PERMET D’IDENTIFIER LES ESPECES SUIVANTES:
S. aureus subsp. aureus |
S. saprophyticus |
S. epidermidis |
S. cohnii subsp. cohnii |
S. capitis subsp. capitis |
S. cohnii subsp. urealyticum |
S. capitis subsp. ureolyticus |
S. xylosis |
S. caprae |
S. simulans |
S. warneri |
S. carnosus |
S. haemolyticus |
S. intermedius |
S. hominis |
S. hyicus |
S. lugdunensis |
S. chromogenes |
S. schleiferi |
S. sciuri |
S. auricularis |
S. lentus |
Mises En Garde Et Precautions
- Ces bandelettes sont destinées à l’usage in vitro uniquement ; seuls des laborantins diplômés utilisant des techniques
aseptiques et prenant les précautions qui s’imposent contre les risques microbiologiques peuvent les utiliser.
- Passer les matériaux utilisés à l’autoclave, les incinérer ou les immerger dans du germicide avant de les éliminer.
- NE PAS incuber les bandelettes 12S dans un incubateur à CO2 car les substrats et/ou les réactions enzymatiques pourraient
être affecté(e)s et donner de faux résultats.
Conservation
Conserver entre 2 et 8°C. Les bandelettes réactives restent stables jusqu’à la date limite d’utilisation lorsque conservées dans leur sachet en papier aluminium non ouvert et sous cette température.
Presentation Du Kit
Chaque kit contient
20 bandelettes réactives Microbact™ Staph 12S à 12 cupules chacune contenant un substrat déshydraté différent, tel que décrit dans la table des substrats.
- 21 flacons contenant 3 ml de milieux de suspension MicrobactTM Staph 12S à base d’agents tampons et de peptones servant à préparer l’inoculum.
- 1 plateau support.
- La notice du produit technique.
- Formulaire compte-rendu de l’ID du germe incluant la Table d’interprétation des couleurs.
- Formulaires compte-rendus.
Material Requis Mais Non Fourni
Le matériel ci-dessous pourrait être nécessaire mais n’est
pas fourni dans le kit:
- Réactif bleu solide Staph Microbact? 2 x 10 mL (code MB1588A)
- Progiciel d’identification assistée par ordinateur Microbact™ (code MB1244A)
- Huile minérale stérile (code MB1093A)
- Anses de repiquage
- Pipettes stériles
- Réactif au latex pour staphylocoques (codes DR0850M, DR0850B)/Coagulase
- Plaques DNase et HCL 1N
- Incubateur (35 +/ 2°C)
Procedure De Preparation
Isolement
La procédure fondamentale pour la culture et l’isolement de bactéries des espèces du genre Staphylococcus ou de staphylocoques
dans des spécimens cliniques a été bien documentée. Quand on cherche à isoler les espèces Staphylococcus, chaque spécimen doit être
cultivé sur plaque à la gélose au sang et dans d’autres milieux appropriés au spécimen.
Sur la gélose au sang, il se produit une prolifération abondante des espèces du genre Staphylococcus et de staphylocoques entre
18 et 24 heures. Etant donné qu’il est impossible de distinguer une espèce d’une autre durant cette période, les colonies ne seront
sélectionnées à ce moment-là que pour des tests d’identification préliminaires. Il faut laisser les colonies proliférer pendant 2 à 3
jours de plus avant de confirmer la plaque d’isolement primaire pour déterminer quelles sont les espèces présentes.
Si les plaques ne sont pas gardées pendant cette période, il se peut que des cultures mixtes soient utilisées
dans le procédé d'identification et que cela donne de faux résultats. Les spécimens provenant de
sources très contaminées doivent être ensemencés en stries dans des milieux sélectifs pour
les espèces Staphylococcus ou pour les staphylocoques, tels que la gélose
mannitol-sel ou
la gélose CNA Columbia. Ces milieux
inhibent la pousse des germes Gram négatif
mais permettent celle des espèces Staphylococcus , des staphylocoques et d'autres cocci Gram positif.
Tests
supplémentaires
Avant d’utiliser le système Microbact™ Staph 12S, il sera nécessaire d’effectuer quelques tests supplémentaires.
Les résultats obtenus seront notés sur le formulaire compte-rendu et entrés dans le progiciel de l’ordinateur pour aider l’identification.
Résultats des tests requis:
1. Résultats
des tests pour coagulase/au latex staphylococcique
On dispose de nombreux systèmes de détection de la coagulase, mais le test d'agglutination sur lame
utilisant du plasma humain ou de lapin est l'un des plus courants. Le latex staphylococcique est un autre moyen rapide et
commode de détecter la coagulase. Le test Oxoid Staphytect Plus est
un test précis
et très spécifique qui peut être utilisé conjointement avec le système 12S pour une
identification efficace des staphylocoques.
2. Détection de la désoxyribonucléase
(Dnase)
Le test de détection de la DNase est un test facile à effectuer et utile qui peut énormément aider à
identifier diverses espèces du genre Staphylococcus.
Les espèces
de staphylocoques autres que S.aureus qui peuvent produire de la désoxyribonucléase
incluent: S. caprae, S. hyicus, S. chromogens, S.
intermedius.
3. Pigment
La production de pigment peut être une addition utile au procédé d'identification des staphylocoques.
Par pigment positif, on entend la détection visuelle de pigments caroténoïdes (par ex. jaune,
jaune orangé ou orange) durant le développement des colonies sous températures
d'incubation ou ambiantes normales.
Il est souvent difficile de visualiser des
colonies pigmentées. Pour aider à
les visualiser, on peut utiliser un écouvillon blanc pour prélever une ou plusieurs colonies sur la plaque
de gélose. L'écouvillon peut ensuite être examiné contre un fond blanc pour faire contraste et détecter
la couleur du pigment. La production de pigments sur des milieux à base de sang est souvent médiocre. On peut amplifier la
couleur des pigments en ajoutant du lait, de la graisse, du monoacétate de glycérol ou du savon aux milieux tels que
la gélose tryptone-soja (ATS).
Il est plus facile de visualiser la couleur
des colonies sur cette gélose que sur de la gélose à base
de sang.
Les espèces du genre Staphylococcus qui peuvent produire des
pigments incluent: S. aureus, S. chromogens, S. scuiri, S.
lugdunensis.
Identification
Sur les géloses non sélectives, les colonies isolées
de Staphylococcus ont un diamètre de 1 à
3 mm après 24 heures et un diamètre de 3 à 8 mm après 3 jours d'incubation en aérobiose à
35 ± 2°C . Certaines espèces comme S. auricularis peuvent
demander 24 à 36 heures d'incubation avant
qu'une colonie détectable ne se développe.
Le système Microbact™ Staph
12S ne doit être utilisé que pour l'identification
des espèces Staphylococcus. Avant d'effectuer le test, il est
nécessaire de vérifier les
isolats pour s'assurer qu'ils appartiennent au genre Staphylococcus .
Les
staphylocoques sont des cocci Gram positif (diamètre compris entre 0,5 et 1,5 mm) qui apparaissent seuls et en paires,
en tétrades, en chaînes courtes (trois ou quatre cellules) et en structures ressemblant à des grappes
irrégulières. Ce sont des anaérobies facultatifs immobiles, non sporulés et produisant
une réaction catalase positive.
Le genre Micrococcus et les genres
associés peuvent être éliminés car ils sont incapables de
proliférer en anaérobiose et de résister au furazolidone
(disque de 100 mg)5.
Preparation De L’inoculum
Sélectionner 2 à 5 colonies isolées
(en fonction de la taille des colonies) dans une
culture pure de 18 à 24 heures et émulsifier dans 3 ml de milieu de suspension staphylococcique.
Bien mélanger pour obtenir une suspension homogène.
Inoculation
- Sortir une bandelette réactive de son sachet en papier aluminium et la placer sur le plateau-support. Apposer une étiquette appropriée.
- Retirer le couvercle de la bandelette réactive.
- Au moyen d'une pipette de Pasteur stérile, ajouter 4 gouttes (100 ml) de suspension bactérienne dans chaque cupule.
- Recouvrir la cupule no. 7, arginine (repérée par un cercle noir sur la bandelette réactive) de 2 gouttes d'huile minérale (code MB1093A). Remettre le couvercle.
- Placer 1 goutte de l'inoculum sur un milileu non sélectif approprié (par
ex. GTS ou gélose Columbia) pour une vérification de la pureté et
incuber à 35 ± 2°C pendant 24 heures. Si la pousse sur la
plaque indique que la suspension n'était pas pure, le test doit être
considéré non valide et il doit être refait.
Incubation
Incuber les bandelettes réactives inoculées à 35 ± 2°C en aérobiose pendant 24 heures. S’il est impossible d’interpréter
le résultat avec certitude après 24 heures, on peut remettre les bandelettes dans l’incubateur et lire
à nouveau le résultat après une période supplémentaire d’incubation.
Lecture Du Resultat Sur La Bandelette Reactive
- Si nécessaire, reconstituer le réactif bleu acide ( code MB1588A ) en versant tout le contenu du flacon de diluant dans le flacon de réactif. Bien mélanger et écrire la date de reconstitution sur le flacon. Une fois reconstitué, le réactif bleu acide a une durée de conservation de 8 semaines.
- Sortir la bandelette réactive de l'incubateur.
- Retirer le couvercle.
- Ajouter une goutte de réactif bleu acide dans la cupule no. 12, repérée par un cercle vert sur la bandelette réactive (bêta-galactosidase). Si le test est positif, la couleur sera remplacée par un pourpre prune en 5 à 10 secondes.
- Enregistrer tous les résultats des tests dans les Formulaires compte-rendus d'ID de germes Microbact™ fournis
dans le kit. Utiliser la table des couleurs figurant sur le volet intérieur du tampon pour faciliter l'interprétation des
changements de couleur dans chaque cupule de la bandelette 12S. A la page 2 de ce manuel se trouve une table
des substrats/réactions donnée à titre de guide pour interpréter les réactions. Les réactions
positives sont indiquées par un + et les réactions négatives par un -
Interpretation
Une fois que chaque réaction est enregistrée sur le formulaire compte rendu, convertir chaque bloc de trois réactions
en une valeur numérique. Si la réaction dans la cupule est considérée positive, la valeur numérique
indiquée sous le résultat (numéro d'indice de la réaction) sera incluse. Ajouter les trois numéros
entre eux pour obtenir le chiffre du code Microbact ™ qui est soit comparé au registre des profils, soit entré dans
le progiciel de l'ordinateur.
Exemple:
|
Résultat |
Indice de la réaction |
Somme des réactions positives |
Maltose |
+ |
4 |
4 |
Mannitol |
- |
2 |
Mannose |
- |
1 |
Sucrose |
+ |
4 |
4 |
Tréhalose |
- |
2 |
N-Acetyl glucosamine |
- |
1 |
Arginine |
+ |
4 |
6 |
Uréase |
+ |
2 |
Bêta-Glucosidase |
- |
1 |
Alkaline Phosphatase |
+ |
4 |
4 |
Bêta-Glucuronidase |
- |
2 |
Bêta-Galactosidase |
- |
1 |
Latex/Coagulase |
- |
4 |
0 |
Dnase |
- |
2 |
Pigment |
- |
? |
Code Microbact™ = 44640
Les réactions aux tests, par l'intermédiaire du numéro code à cinq
chiffres, sont entrées
dans le Progiciel d'identification assistée par ordinateur Microbact™ produisant
une ID d'espèce
probable du genre Staphylococcus. Les résultats peuvent aussi être
entrés individuellement dans le
progiciel si on le préfère. Consulter le dossier 'Aide' du progiciel Microbact™ pour
plus
de détails.
Le progiciel permet aussi de changer des réactions individuelles une fois qu'elles ont été entrées.
Dans les cas où il est difficile d'interpréter les résultats des réactions, ou s'ils ne
sont pas connus, on peut utiliser le point d'interrogation (?). Sur les 12 réactions, on peut entrer un maximum de 2 sous forme
de points d'interrogation. Pour tous les détails, consulter le dossier ‘Aide'
du progiciel Microbact™.
Consulter le Progiciel d'identification
assistée par ordinateur Microbact™ pour les choix d'identification.
Le pourcentage indiqué à côté du nom du germe est la part de pourcentage de la probabilité qu'il
s'agisse de ce germe parmi le total des probabilités de tous les choix.
Controle De La Qualite
La performance générale du système doit être contrôlée en testant des souches témoins appropriées. Les germes suivants
sont recommandés pour une évaluation par un laboratoire indépendant.
Staphylococcus aureus ATCC®25923 |
Oxoid Cultiloops® C7010L |
Staphylococcus epidermidis ATCC®12228 |
Oxoid Cultiloops® C6500L |
Staphylococcus saprophyticus ATCC®15305 |
Oxoid Cultiloops® C7014L |
Le tableau suivant indique les résultats attendus sur le système Microbact™ 12S après 18 à 24 heures d’incubation.
|
S. aureus
ATCC ®25923 |
S. epidermidis
ATCC®12228 |
S. saprophyticus
ATCC®15305 |
Maltose |
+ |
+ |
+ |
Mannitol |
+ |
- |
+ |
Mannose |
+ |
- |
- |
Sucrose |
+ |
+ |
+ |
Trehalose |
+ |
- |
+ |
N-Acetyl glucosamine |
+ |
- |
- |
Arginine |
+ |
+ |
- |
Uréase |
+ |
+ |
+ |
Bêta-Glucosidase |
+ |
- |
- |
Alkaline Phosphatase |
+ |
+ |
- |
Bêta-Glucuronidase |
- |
- |
- |
Bêta-Galactosidase |
- |
- |
+ |
Limites Du Test
- Certaines souches de staphylocoques risquent de donner des réactions biochimiques atypiques en raison d’exigences nutritionnelles inhabituelles et il peut s’avérer difficile de les identifier.
- Une incubation prolongée, une incubation insuffisante, un mauvais remplissage des cupules ou un inoculum inadéquat risquent de donner de faux résultats.
- Les réactions obtenues en utilisant le Système Microbact™ Staph 12S risquent de différer des résultats publiés en se servant d’autres formules de substrats.
- Les espèces avec un faible taux d’occurrence devront parfois être à nouveau testées.
- Les résultats d’identification calculés mathématiquement doivent être interprétés par du personnel diplômé qui doit faire appel
à son propre jugement et à ses connaissances, ainsi qu’aux informations suivantes, avant d’accepter l’identification d’un germe : coloration de Gram, morphologie de la colonie, source de l’isolat, pourcentage de probabilité, tests contre, tests supplémentaires,
fréquence du choix d’ID et antibiogramme.
References
-
Rhoden, DL, Miller, JM Four-year prospective study of STAPH-IDENT system and
conventional method for reference identification of Staphylococcus, Stomatococcus,
and Micrococcus
spp. J. Clin. Microbiol. 1995 33: 96-98
-
Kloos, WE, Bannerman, TL Update on clinical significance of coagulase-negative
staphylococci Clin. Microbiol. Rev. 1994 7: 117-140
-
Kloos, WE, Bannerman, TL 1999. Staphylococcus and Micrococcus, p. 264 – 282.
In P. R. Murray, E. J. Baron, M. A. Pfaller, F. C. Tenover, R.H. Yolken (ed)
Manual of Clinical Microbiology, 7th ed. American Society of Microbiology, Washington
D.C.
-
Geary, C, Stevens, M, Sneath, PHA, Mitchell, CJ Construction of a database to
identify Staphylococcus J. Clin. Pathol. 1989;42:289 - 294
-
Hebert, GA, Crowder, GC, Hancock, GA, Jarvis, WR, Thornsberry, C Characteristics
of Coagulase-Negative Staphylococci That Help Differentiate These Species and
Other Members of the Family Micrococcaceae J. Clin. Microbiol. 1988 26:1939-1949
-
Ieven, M, Verhoeven, J, Pattyn, SR, Goossens, H Rapid and Economical Method for
Species Identification of Clinically Significant Coagulase-Negative Staphylococci
J. Clin. Microbiol. 1995 33:1060-1063
-
Bascomb, S Enzyme Tests in Bacterial Identification Methods in Microbiology 1987
Volume 19:Chapter 3, 105-160
-
Bascomb, S, Manafi, M Use of Enzyme Tests in Characterisation and Identification
of Aerobic and Facultatively Anaerobic Gram-positive Cocci
Clin. Microbiol. Rev. 1998 11: 318-340
-
McTaggart, L, Elliot, TSJ Is resistance to novobiocin a reliable test for confirmation
of the identification of Staphylococcus saprophyticus?
J. Med. Microbiol. 1989 30: 253-266
-
McFaddin, JF Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria Lippincott
Williams & Wilkins 3rd Edition 2000
|
|