STAPHLOCOCCAL 12S IDENTIFICATION SYSTEM

CODE: MB1561

Introduction
Les staphylocoques restent un élément important de la flore commensale humaine, les staphylocoques produisant une réaction coagulase négative en représentant le plus grand pourcentage 1. Bien qu'ils soient des contaminants fréquents, les staphylocoques sont devenus des germes nosocomiaux importants, en partie en raison de l'usage accru d'appareils médicaux à demeure. Etant maintenant devenus aussi importants, il est crucial que les laboratoires de microbiologie puissent identifier chaque espèce de staphylocoques qui produisent une réaction coagulase négative 2.

Usage Prevu
Le système Microbact™ Staph 12S repose sur les systèmes d'identification classiques 3,10. Grâce à l'usage associé de sucres et de substrats enzymatiques colorimétriques, le 12S est en mesure d'identifier 22 des espèces cliniques de staphylocoques les plus importantes 2, y compris celles qui produisent des réactions coagulase négative et coagulase positive.
Le système Microbact™ Staph 12S est conçu pour identifier uniquement les espèces Staphylococcus . Les staphylocoques sont des cocci Gram positif (de 0,5 à 1,5 mm de diamètre) ; ce sont des anaérobies facultatifs immobiles non sporulés et qui produisent une réaction catalase positive.
Micrococcus et les genres associés peuvent être éliminés car ils ne peuvent pas proliférer en anaérobiose et résister au furazolidone (disque de 100 mg) 5.

Principe Du Test
Le système Microbact™ Staph 12S est un système de microsubstrats normalisé conçu pour imiter les substrats biochimiques classiques dont on se sert pour identifier les espèces Staphylococcus. Chaque bandelette d’identification comporte 12 tests. Les réactions qui se produisent durant la période d’incubation sont mises en évidence par un changement de couleur qu’il est facile d’interpréter. Les tests avec utilisation de sucres comptent sur un changement de couleur d’un indicateur de pH, alors que les substrats d’identification enzymatiques produisent un produit terminal coloré ou réagissent avec un indicateur ajouté.
L’identification des bactéries repose sur le changement du pH et l’utilisation de substrats, tel qu’il est établi dans les références publiées 3,4,6,7,8,9. Se référer à la table des substrats/réactions de la page 2 qui indique les principes réactionnels et les changements de couleur spécifiques.
Chaque espèce de Staphylococcus produit un modèle différent de réactions. Quand les résultats des réactions sont entrés dans le progiciel Microbact™ en utilisant un code numérique, une identification probable de l’espèce de Staphylococcus en question est produite. Oxoid agrandit et améliore constamment sa base de données de réactions indépendante à utiliser avec le système Microbact™ Staph 12S.

TABLE DES SUBSTRATS ET DES REACTIONS:

Cupule No.
Désignation
Principe de la réactio
Réaction
Commentaires
Négative
Positive
1
Maltose
Utilisation de sucres spécifiques résultant en la production de produits terminaux acides
Rouge
Jaune
L’indicateur au rouge de phénol change de couleur quand on utilise le sucre approprié produisant de l’acide
2
Mannitol
Rouge
Jaune
3
Mannose
Rouge
Jaune
4
Sucrose
Rouge
Jaune
5
Tréhalose
Rouge
Jaune
6
N-acétyl glucosamine
Rouge
Jaune
7
Utilisation d’arginine
Détection de l’arginine dihydrolase après 24 heures
Jaune/vert olive
Vert/bleu
L’arginine dihydrolase convertit l’arginine en ornithine, ammoniaque et anhydride carbonique. L’augmentation du pH est indiquée par le bleu de bromothymol. Les réactions donnant une couleur verte et se produisant après 48 heures doivent être interprétées comme négatives.
8
Test de l’uréase
Hydrolyse de l’urée
Paille/jaune
Rose/rouge
L’uréase fractionne l’urée en anhydride carbonique et en ammoniaque. L’augmentation du pH est indiquée par le rouge de phénol.
9
Bêta-glucosidase
Hydrolyse du p-nitrophenyl- ß-D-glucopyranoside par l’action de la ß-glucosidase
Jaune pâle/incolore
Jaune vif
L’hydrolyse du p-nitrophényl- ß-d-glucopyranoside incolore libère du p-nitrophénol jaune.
10
Alkaline phosphatase
Hydrolyse du p-nitrophényl-phosphate par action de l’alcaline phosphatase
Jaune pâle/incolore
Jaune vif
L’hydrolyse du p-nitrophényl-phosphate incolore libère du p-nitrophénol jaune
11
Bêta-glucuronidase
Hydrolyse du p-nitrophényl-ß-D-glucuronide par action de la ß-glucuronidase
Jaune pâle/incolore
Jaune vif
L’hydrolyse du p-nitrophényl- ß-d-glucuronide incolore libère du p-nitrophénol jaune
12
Bêta-galactosidase
Hydrolyse du p-nitrophényl-ß-D-glucuronide par action de la ß-glucuronidase
Jaune pâle/incolore
Mauve prune
L’hydrolyse du ß-naphtyl- ß-d-galactopyranoside incolore libère du ß-naphtol qui est détecté par le sel BB bleu acide qui vire au mauve

LE SYSTEME MICROBACT™ STAPH 12S PERMET D’IDENTIFIER LES ESPECES SUIVANTES:

S. aureus subsp. aureus S. saprophyticus
S. epidermidis S. cohnii subsp. cohnii
S. capitis subsp. capitis S. cohnii subsp. urealyticum
S. capitis subsp. ureolyticus S. xylosis
S. caprae S. simulans
S. warneri S. carnosus
S. haemolyticus S. intermedius
S. hominis S. hyicus
S. lugdunensis S. chromogenes
S. schleiferi S. sciuri
S. auricularis S. lentus

Mises En Garde Et Precautions

  1. Ces bandelettes sont destinées à l’usage in vitro uniquement ; seuls des laborantins diplômés utilisant des techniques aseptiques et prenant les précautions qui s’imposent contre les risques microbiologiques peuvent les utiliser.
  2. Passer les matériaux utilisés à l’autoclave, les incinérer ou les immerger dans du germicide avant de les éliminer.
  3. NE PAS incuber les bandelettes 12S dans un incubateur à CO2 car les substrats et/ou les réactions enzymatiques pourraient être affecté(e)s et donner de faux résultats.

Conservation
Conserver entre 2 et 8°C. Les bandelettes réactives restent stables jusqu’à la date limite d’utilisation lorsque conservées dans leur sachet en papier aluminium non ouvert et sous cette température.

Presentation Du Kit
Chaque kit contient

  • 20 bandelettes réactives Microbact™ Staph 12S à 12 cupules chacune contenant un substrat déshydraté différent, tel que décrit dans la table des substrats.
  • 21 flacons contenant 3 ml de milieux de suspension MicrobactTM Staph 12S à base d’agents tampons et de peptones servant à préparer l’inoculum.
  • 1 plateau support.
  • La notice du produit technique.
  • Formulaire compte-rendu de l’ID du germe incluant la Table d’interprétation des couleurs.
  • Formulaires compte-rendus.

Material Requis Mais Non Fourni
Le matériel ci-dessous pourrait être nécessaire mais n’est pas fourni dans le kit:

  • Réactif bleu solide Staph Microbact? 2 x 10 mL (code MB1588A)
  • Progiciel d’identification assistée par ordinateur Microbact™ (code MB1244A)
  • Huile minérale stérile (code MB1093A)
  • Anses de repiquage
  • Pipettes stériles
  • Réactif au latex pour staphylocoques (codes DR0850M, DR0850B)/Coagulase
  • Plaques DNase et HCL 1N
  • Incubateur (35 +/ 2°C)

Procedure De Preparation
Isolement
La procédure fondamentale pour la culture et l’isolement de bactéries des espèces du genre Staphylococcus ou de staphylocoques dans des spécimens cliniques a été bien documentée. Quand on cherche à isoler les espèces Staphylococcus, chaque spécimen doit être cultivé sur plaque à la gélose au sang et dans d’autres milieux appropriés au spécimen.
Sur la gélose au sang, il se produit une prolifération abondante des espèces du genre Staphylococcus et de staphylocoques entre 18 et 24 heures. Etant donné qu’il est impossible de distinguer une espèce d’une autre durant cette période, les colonies ne seront sélectionnées à ce moment-là que pour des tests d’identification préliminaires. Il faut laisser les colonies proliférer pendant 2 à 3 jours de plus avant de confirmer la plaque d’isolement primaire pour déterminer quelles sont les espèces présentes.
Si les plaques ne sont pas gardées pendant cette période, il se peut que des cultures mixtes soient utilisées dans le procédé d'identification et que cela donne de faux résultats. Les spécimens provenant de sources très contaminées doivent être ensemencés en stries dans des milieux sélectifs pour les espèces Staphylococcus ou pour les staphylocoques, tels que la gélose mannitol-sel ou la gélose CNA Columbia. Ces milieux inhibent la pousse des germes Gram négatif mais permettent celle des espèces Staphylococcus , des staphylocoques et d'autres cocci Gram positif.
Tests supplémentaires
Avant d’utiliser le système Microbact™ Staph 12S, il sera nécessaire d’effectuer quelques tests supplémentaires. Les résultats obtenus seront notés sur le formulaire compte-rendu et entrés dans le progiciel de l’ordinateur pour aider l’identification.

Résultats des tests requis:
1. Résultats des tests pour coagulase/au latex staphylococcique
On dispose de nombreux systèmes de détection de la coagulase, mais le test d'agglutination sur lame utilisant du plasma humain ou de lapin est l'un des plus courants. Le latex staphylococcique est un autre moyen rapide et commode de détecter la coagulase. Le test Oxoid Staphytect Plus est un test précis et très spécifique qui peut être utilisé conjointement avec le système 12S pour une identification efficace des staphylocoques.
2. Détection de la désoxyribonucléase (Dnase)
Le test de détection de la DNase est un test facile à effectuer et utile qui peut énormément aider à identifier diverses espèces du genre Staphylococcus.
Les espèces de staphylocoques autres que S.aureus qui peuvent produire de la désoxyribonucléase incluent: S. caprae, S. hyicus, S. chromogens, S. intermedius.
3. Pigment
La production de pigment peut être une addition utile au procédé d'identification des staphylocoques. Par pigment positif, on entend la détection visuelle de pigments caroténoïdes (par ex. jaune, jaune orangé ou orange) durant le développement des colonies sous températures d'incubation ou ambiantes normales.
Il est souvent difficile de visualiser des colonies pigmentées. Pour aider à les visualiser, on peut utiliser un écouvillon blanc pour prélever une ou plusieurs colonies sur la plaque de gélose. L'écouvillon peut ensuite être examiné contre un fond blanc pour faire contraste et détecter la couleur du pigment. La production de pigments sur des milieux à base de sang est souvent médiocre. On peut amplifier la couleur des pigments en ajoutant du lait, de la graisse, du monoacétate de glycérol ou du savon aux milieux tels que la gélose tryptone-soja (ATS).
Il est plus facile de visualiser la couleur des colonies sur cette gélose que sur de la gélose à base de sang.
Les espèces du genre Staphylococcus qui peuvent produire des pigments incluent: S. aureus, S. chromogens, S. scuiri, S. lugdunensis.

Identification
Sur les géloses non sélectives, les colonies isolées de Staphylococcus ont un diamètre de 1 à 3 mm après 24 heures et un diamètre de 3 à 8 mm après 3 jours d'incubation en aérobiose à 35 ± 2°C . Certaines espèces comme S. auricularis peuvent demander 24 à 36 heures d'incubation avant qu'une colonie détectable ne se développe.
Le système Microbact™ Staph 12S ne doit être utilisé que pour l'identification des espèces Staphylococcus. Avant d'effectuer le test, il est nécessaire de vérifier les isolats pour s'assurer qu'ils appartiennent au genre Staphylococcus .
Les staphylocoques sont des cocci Gram positif (diamètre compris entre 0,5 et 1,5 mm) qui apparaissent seuls et en paires, en tétrades, en chaînes courtes (trois ou quatre cellules) et en structures ressemblant à des grappes irrégulières. Ce sont des anaérobies facultatifs immobiles, non sporulés et produisant une réaction catalase positive.
Le genre Micrococcus et les genres associés peuvent être éliminés car ils sont incapables de proliférer en anaérobiose et de résister au furazolidone (disque de 100 mg)5.

Preparation De L’inoculum
Sélectionner 2 à 5 colonies isolées (en fonction de la taille des colonies) dans une culture pure de 18 à 24 heures et émulsifier dans 3 ml de milieu de suspension staphylococcique. Bien mélanger pour obtenir une suspension homogène.
Inoculation

  1. Sortir une bandelette réactive de son sachet en papier aluminium et la placer sur le plateau-support. Apposer une étiquette appropriée.
  2. Retirer le couvercle de la bandelette réactive.
  3. Au moyen d'une pipette de Pasteur stérile, ajouter 4 gouttes (100 ml) de suspension bactérienne dans chaque cupule.
  4. Recouvrir la cupule no. 7, arginine (repérée par un cercle noir sur la bandelette réactive) de 2 gouttes d'huile minérale (code MB1093A). Remettre le couvercle.
  5. Placer 1 goutte de l'inoculum sur un milileu non sélectif approprié (par ex. GTS ou gélose Columbia) pour une vérification de la pureté et incuber à 35 ± 2°C pendant 24 heures. Si la pousse sur la plaque indique que la suspension n'était pas pure, le test doit être considéré non valide et il doit être refait.         

Incubation
Incuber les bandelettes réactives inoculées à 35 ± 2°C en aérobiose pendant 24 heures. S’il est impossible d’interpréter le résultat avec certitude après 24 heures, on peut remettre les bandelettes dans l’incubateur et lire à nouveau le résultat après une période supplémentaire d’incubation.

Lecture Du Resultat Sur La Bandelette Reactive

  1. Si nécessaire, reconstituer le réactif bleu acide ( code MB1588A ) en versant tout le contenu du flacon de diluant dans le flacon de réactif. Bien mélanger et écrire la date de reconstitution sur le flacon. Une fois reconstitué, le réactif bleu acide a une durée de conservation de 8 semaines.
  2. Sortir la bandelette réactive de l'incubateur.
  3. Retirer le couvercle.
  4. Ajouter une goutte de réactif bleu acide dans la cupule no. 12, repérée par un cercle vert sur la bandelette réactive (bêta-galactosidase). Si le test est positif, la couleur sera remplacée par un pourpre prune en 5 à 10 secondes.
  5. Enregistrer tous les résultats des tests dans les Formulaires compte-rendus d'ID de germes Microbact™ fournis dans le kit. Utiliser la table des couleurs figurant sur le volet intérieur du tampon pour faciliter l'interprétation des changements de couleur dans chaque cupule de la bandelette 12S. A la page 2 de ce manuel se trouve une table des substrats/réactions donnée à titre de guide pour interpréter les réactions. Les réactions positives sont indiquées par un + et les réactions négatives par un -

Interpretation
Une fois que chaque réaction est enregistrée sur le formulaire compte rendu, convertir chaque bloc de trois réactions en une valeur numérique. Si la réaction dans la cupule est considérée positive, la valeur numérique indiquée sous le résultat (numéro d'indice de la réaction) sera incluse. Ajouter les trois numéros entre eux pour obtenir le chiffre du code Microbact ™ qui est soit comparé au registre des profils, soit entré dans le progiciel de l'ordinateur.

Exemple:

 
Résultat
Indice de la réaction
Somme des réactions positives
Maltose
+
4
4
Mannitol
-
2
Mannose
-
1
Sucrose
+
4
4
Tréhalose
-
2
N-Acetyl glucosamine
-
1
Arginine
+
4
6
Uréase
+
2
Bêta-Glucosidase
-
1
Alkaline Phosphatase
+
4
4
Bêta-Glucuronidase
-
2
Bêta-Galactosidase
-
1
Latex/Coagulase
-
4
0
Dnase
-
2
Pigment
-
?

Code Microbact™ = 44640

Les réactions aux tests, par l'intermédiaire du numéro code à cinq chiffres, sont entrées dans le Progiciel d'identification assistée par ordinateur Microbact™ produisant une ID d'espèce probable du genre Staphylococcus. Les résultats peuvent aussi être entrés individuellement dans le progiciel si on le préfère. Consulter le dossier 'Aide' du progiciel Microbact™ pour plus de détails.
Le progiciel permet aussi de changer des réactions individuelles une fois qu'elles ont été entrées. Dans les cas où il est difficile d'interpréter les résultats des réactions, ou s'ils ne sont pas connus, on peut utiliser le point d'interrogation (?). Sur les 12 réactions, on peut entrer un maximum de 2 sous forme de points d'interrogation. Pour tous les détails, consulter le dossier ‘Aide' du progiciel Microbact™.
Consulter le Progiciel d'identification assistée par ordinateur Microbact™ pour les choix d'identification. Le pourcentage indiqué à côté du nom du germe est la part de pourcentage de la probabilité qu'il s'agisse de ce germe parmi le total des probabilités de tous les choix.

Controle De La Qualite
La performance générale du système doit être contrôlée en testant des souches témoins appropriées. Les germes suivants sont recommandés pour une évaluation par un laboratoire indépendant.

Staphylococcus aureus ATCC®25923

Oxoid Cultiloops® C7010L

Staphylococcus epidermidis ATCC®12228
Oxoid Cultiloops® C6500L
Staphylococcus saprophyticus ATCC®15305

Oxoid Cultiloops® C7014L

Le tableau suivant indique les résultats attendus sur le système Microbact™ 12S après 18 à 24 heures d’incubation.

 
S. aureus
ATCC ®25923
S. epidermidis
ATCC®12228
S. saprophyticus
ATCC®15305
Maltose
+
+
+
Mannitol
+
-
+
Mannose
+
-
-
Sucrose
+
+
+
Trehalose
+
-
+
N-Acetyl glucosamine
+
-
-
Arginine
+
+
-
Uréase
+
+
+
Bêta-Glucosidase
+
-
-
Alkaline Phosphatase
+
+
-
Bêta-Glucuronidase
-
-
-
Bêta-Galactosidase
-
-
+

Limites Du Test

  1. Certaines souches de staphylocoques risquent de donner des réactions biochimiques atypiques en raison d’exigences nutritionnelles inhabituelles et il peut s’avérer difficile de les identifier.
  2. Une incubation prolongée, une incubation insuffisante, un mauvais remplissage des cupules ou un inoculum inadéquat risquent de donner de faux résultats.
  3. Les réactions obtenues en utilisant le Système Microbact™ Staph 12S risquent de différer des résultats publiés en se servant d’autres formules de substrats.
  4. Les espèces avec un faible taux d’occurrence devront parfois être à nouveau testées.
  5. Les résultats d’identification calculés mathématiquement doivent être interprétés par du personnel diplômé qui doit faire appel à son propre jugement et à ses connaissances, ainsi qu’aux informations suivantes, avant d’accepter l’identification d’un germe : coloration de Gram, morphologie de la colonie, source de l’isolat, pourcentage de probabilité, tests contre, tests supplémentaires, fréquence du choix d’ID et antibiogramme.

References

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  8. Bascomb, S, Manafi, M Use of Enzyme Tests in Characterisation and Identification of Aerobic and Facultatively Anaerobic Gram-positive Cocci
    Clin. Microbiol. Rev. 1998 11: 318-340
  9. McTaggart, L, Elliot, TSJ Is resistance to novobiocin a reliable test for confirmation of the identification of Staphylococcus saprophyticus?
    J. Med. Microbiol. 1989 30: 253-266
  10. McFaddin, JF Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria Lippincott Williams & Wilkins 3rd Edition 2000


 

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