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CODE : CM0169

500 grammes permettent de préparer 11,1 litres de milieu.

PREPARATION
Verser 22,5 g de poudre dans 500 ml d’eau distillée. Porter à ébullition jusqu’à dissolution complète. Stériliser 15 minutes à 121°C à l’autoclave.

SUPPLEMENT SELECTIF POUR BRUCELLA (Milieu de farrell)

CODE : SR0083

Chaque flacon permet de supplémenter 500 ml de milieu.

SUPPLEMENT SELECTIF MODIFIE POUR BRUCELLA

CODE : SR0209

Chaque flacon permet de supplémenter 500 ml de milieu.

PREPARATION
Ajouter 10 ml d’un mélange méthanol/eau distillée (50/50) à un flacon et agiter pour former une suspension homogène. Mettre 10 à 15 minutes à 37°C. Agiter et ajouter le contenu d’un flacon à 500 ml de milieu stérile refroidi à 50–55°C.
Utiliser :
La gélose au Sang n°2 (CM0271) ou la gélose de base Columbia (CM0331) ou la gélose de base pour Brucella (CM0169), additionnées de 5–10 % (vol/vol) de sérum de cheval (SR0035) décomplémenté et 1 % (pds/vol) de glucose stérile.

DESCRIPTION
La croissance lente de Brucella sp. qui nécessite des milieux hautement nutritifs, implique que des agents sélectifs doivent être ajoutés pour empêcher la croissance de microorganismes contaminants provenant du lait ou de tissus d’origine animale.
Jones et Brinley Morgan¹ ont montré que des milieux contenant des colorants bactériostatiques sont inhibiteurs des souches de Brucella abortus biotype 2 et d’autres germes exigeants.
Ils ont aussi démontré que des antibiotiques utilisés à la place de colorants permettent la pousse de tous les biotypes de Brucella sp. sur des milieux sélectifs. Cependant Leech et coll.² ont montré que la formule sérum-glucose-antibiotique de Jones et Brinley Morgan n’était pas suffisamment sélective et était moins efficace que l’inoculation au cobaye.
Barrow et Peel³ ont modifié le milieu sélectif créé par Mair⁴. Celui-ci contenait à la fois des antibiotiques et du violet de gentiane. L’absence de pousse de certaines souches de Brucella abortus a confirmé leur sensibilité à de très petites concentrations de colorants, ceci étant reconnu par Mair.
Farrell⁵ a developpé un milieu nutritif hautement sélectif contenant des antibiotiques tels que : bacitracine 25 UI/ml, vancomycine 20 µg/ml,
polymyxine 5UI/ml, acide nalidixique 5 µg/ml, cycloheximide 100 µg/ml et nystatine 100 UI/ml, dans une gélose de base sérum-glucose.
Des essais comparatifs4 ont montré que ce milieu donnait un taux d’isolement équivalent à celui obtenu par l’inoculation au cobaye, et qu’il favorisait la pousse des souches de Brucella abortus biotype 2 .
Le supplément sélectif pour Brucella (SR0083A), est basé sur la formule améliorée de Farrell. Des essais complémentaires⁶ ont montré qu’il était plus efficace dans la suppression de toute contamination bactérienne que la gélose sérum-glucose ou le milieu de Barrow et Peel.
Une formulation modifiée du supplément SR0083A a été développée par Oxoid (SR0209E) : l’antifongique cycloheximide a été remplacé par de la natamycine. La croissance et la récupération de certaines souches de Brucella antérieurement sensibles à la cycloheximide est sensiblement améliorée (Brucella ovis, Brucella melitensis blasco 524).

UTILISATION
1 Pour la culture directe de Brucella sp. à partir du lait, transférer les échantillons dans des tubes stériles et les maintenir à 40°C toute une nuit.
2 Retirer un aliquote de crème avec une oese⁴ et l’étaler sur une boîte de gélose supplémentée avec une tige en verre stérile recourbée.
3 Incuber les boîtes à 37°C dans une atmosphère contenant 10 % de CO2 et examiner les boîtes tous les 2 jours pendant 10 jours.
4 Les colonies de Brucella apparaissent sous forme de colonies convexes bien rondes, de 1 à 2 mm de diamètre et peuvent être identifiées par agglutination sur lame.
La gélose de base pour Brucella Oxoid (CM0169) uniquement additionnée de sérum, donc sans antibiotiques, permet de différencier les souches de Brucella selon la méthode de “Cruickshank dyestrip” ⁸:
1 Imbiber des bandes de papier filtre avec de la fuchsine basique (1/200) ou de la thionine (1/800) ; sécher.
2 Placer ces bandes parallèlement sur la surface de la gélose (avec sérum et glucose) et recouvrir d’une fine couche de ce même milieu. Laisser solidifier.
3 Ensemencer en stries les souches à tester à angles droits par rapport aux bandes.
4 Incuber 2 à 3 jours à 37°C en atmosphère contenant 10 % de CO2.
5 Observer les boîtes. Les souches résistantes poussent à travers la bande de filtre tandis que les souches sensibles montrent une inhibition de croissance à plus de 10 mm de la bande. Une croissance typique suit le schéma suivant :

Cependant, il y a des exceptions et il est préférable de baser l’identification sur plusieurs critères.⁹
Remarque :
Le milieu de base pour Brucella (CM0169), additionné de supplément pour Campylobacter (Skirrow, SR0069 - Butzler, SR0085 – Butzler modifié, SR0207 – Blaser-Wang, SR0098 – supplément de croissance, SR0084) peut aussi être utilisé pour l’isolement des Campylobacter (pour plus de détails, se référer aux milieux sélectifs pour Campylobacter).

CONSERVATION
Conserver le milieu déshydraté à 10–25°C jusqu’à la date de péremption indiquée sur le flacon.
Conserver les boîtes prêtes à l’emploi à 2–8°C.

CONTROLE DE QUALITE
– Avec supplément sélectif pour Brucella
Contrôle positif :
Brucella abortus ATCC® 4315
Contrôle négatif :
Staphylococcus aureus ATCC® 25923
E. coli ATCC® 25922
–Sans antibiotiques
Contrôle positif :
Brucella abortus ATCC® 4315
–Avec supplément sélectif pour Campylobacter
Contrôle positif :
Campylobacter jejuni ATCC® 29428
Contrôle négatif :
Staphylococcus aureus ATCC® 25923
E. coli ATCC® 25922

PRECAUTIONS
Les espèces de Brucella sont très infectieuses ; il faut donc manipuler les cultures dans un endroit protégé.

BIBLIOGRAPHIE
1 Jones L.M. and Brinley Morgan W.J. (1958) Bull. Wld. Hlth.Org., 19. 200. p. 576.
2 Leech F.B., Vessey. M.P., Macrae W.D., Lawson J.R., MacKinnon D.J. and Brinley Morgan W.J. (1964) Animal Disease : Survey
No. 4, HMSO, London, p. 17.
3 Barrow G.I. and Peel M. (1967) Mon. Bull. Minist. Hlth., 26.192-196.
4 Mair N.S. (1955) Mon. Bull. Minist. Hlth., 14. 184-191.
5 Farrell I.D. and Robinson L. (1972) J. Appl. Bact., 35. 625-630.
6 Hunter D. and Kearns M. (1977) Br. Vet. J., 133. 48 & 489.
7 Farrell I.D. (1969) PhD Thesis, University of Liverpool, cited in Reference 4.
8 Cruickshank J.C. (1948) J. Path. Bact., 60. 328-329.
9 Stableforth A.W. and Jones Lois M. (1963) Internat.Bull Bact. Nomen. Taxon., 13. 145-158