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AFPA (MILIEU)

Milieu sélectif pour la détection et l’identification d’ Aspergillus flavus et A. parasiticus .

GELOSE DE BASE

CODE : CM0731

SUPPLEMENT CHLORAMPHENICOL

CODE : SR0078

PREPARATION
Mettre 22,75 g dans 500 ml (45.5g/L) d’eau distillée et chauffer jusqu’à dissolution complète. Reconstituer comme indiqué 1 flacon de SR0078E pour 500ml de milieu ou 1 flacon de SR0078H pour 2 L de milieu. Ajouter le flacon à la base AFPA. Stériliser à 121° C pendant 15 minutes à l’autoclave. Laisser refroidir jusqu’à 50° C. Bien mélanger et répartir en boîtes de Pétri stériles.

DESCRIPTION
Le milieu de culture idéal pour l’isolement et la numération des levures et moisissures dans les aliments doit permettre la récupération de toutes les formes viables, restreindre l’envahissement par les moisissures, inhiber la croissance bactérienne et aider à l’identification des champignons.

Aspergillus flavus et Aspergillus parasiticus sont des champignons qui potentiellement peuvent produire des résidus de toxines dangereuses comme l’aflatoxine.
Ils touchent surtout les oléagineux, les noix et les céréales dans les régions subtropicales et tropicales dans le monde entier en raison de conditions de stockage inadéquates.

Les toxines sont particulièrement cancérigènes chez l'homme et l’ingestion des aliments contaminés peut entraîner un cancer du foie, parmi d'autres maladies. Le cancer du foie met du temps à se développer, mais les aflatoxines agissent également comme un immunosuppresseur de ce fait  les personnes concernées deviennent sensibles à un large éventail de maladies. Les animaux d'élevage sont également en péril et les volailles sont particulièrement sensibles : plus de 200 000 poulets sont morts en 1994, en Inde (Andhra Pradesh) Inde, après avoir mangé des aliments contaminés. Les bovins ne sont pas tellement sensibles mais, mais si les animaux sont nourris avec des aliments contaminés, la toxine peut se retrouvée dans le lait.

En plus de mettre en danger la santé de l'homme, les contaminations par les aflatoxines compromettent sérieusement le potentiel d'exportation des produits de cultures  de haute valeur ajoutée, tels que les noix (arachide, pistache, cajou et amande) et les épices (le curcuma et poivrons), qui pourraient fournir une importante source de revenus pour les agriculteurs dans les régions tropicales semi-arides.
Le diagnostic, ou même la prévention, de la contamination par les aflatoxines permettra aux agriculteurs de bénéficier de l'augmentation du commerce. Ceci contribuera également à l'amélioration de la santé générale des personnes, souvent pauvres, qui consomment des aliments contaminés.

 La FDA a établi des lignes directrices spécifiques sur les niveaux acceptables de contamination par les aflatoxines dans l'alimentation humaine et animale en établissant des niveaux d'action qui permettent le retrait de lots contaminés de la chaîne alimentaire.
Le niveau d'action pour l'alimentation humaine est de 20 ppb en aflatoxines totales, à l'exception du lait qui a un niveau d'action de 0,5 ppb pour les aflatoxines M1. Le niveau d'action pour la plupart des aliments est également 20 ppb.  Cependant, il est très difficile d'estimer avec précision les concentrations d’aflatoxines dans une grande quantité de matière en raison de la variabilité associée aux procédures de tests ; par conséquent, la concentration réelle en aflatoxines dans un lot ne peut pas être déterminée avec une certitude de 100 %.

La gélose AFPA (CM0731) basée sur la formule de Pitt, Hoching et Glenn 2, s’approche de cet idéal. Elle est recommandée pour la détection rapide et la numération des 2 espèces d’Aspergillus flavus et parasiticus qui sont des producteurs potentiels d’aflatoxines.

L’AFPA CM731 est une modification du milieu différentiel pour Aspergillus 3 et présente les avantages suivants :
1   Amélioration de la coloration du dos de la colonie grâce à une concentration optimale d’un sel ferrique soluble et à l’addition d’extrait de levure. Les colonies d’ A. flavus / parasiticus développent une intense coloration jaune-orangé au dos des colonies ; cela constitue un caractère différentiel de ces espèces.
2   Amélioration de la vitesse de pousse d’ A. flavus par un rapport optimal entre la peptone et l’extrait de levure.
3   Inhibition plus importante des bactéries et croissance rapide des champignons grâce au mélange dichloran-chloramphénicol.

UTILISATION
1   Préparer l’échantillon dans un stomacher en utilisant 40 g d’aliments dans 200 ml d’eau peptonée à 0,1 % (CM0733b). Ou bien, ajouter l’échantillon dans l’eau peptonée à 0,1 % et agiter périodiquement pendant 30 minutes.
2   Diluer l’échantillon au 1/10, 1/20 et 1/40 à l’aide d’eau peptonée à 0,1 %.
3   Ensemencer en surface 0,1 ml de chaque dilution.
4   Lecture après 42 à 43 h d’incubation à 30° C.
5   Compter toutes les colonies * présentant une pigmentation caractéristique jaune-orangé au dos de la colonie.
6   Rendre les résultats en nombre de colonies d’A. flavus / parasitus par gramme de produit.
* Aspergillus oryzae peut produire la même pigmentation jaune-orangé. Il est important dans la production d’aliments fermentés en provenance d’Asie, particulièrement la sauce de soja. Il est très rarement isolé à partir d’autres sources.
A. brasiliensis  est une source d’erreur possible car il produit des colonies de taille et de texture similaires à A. flavus à 30° C. Cependant, les colonies ne sont jamais jaune-orangé. Elles peuvent être jaune pâles au dos. Après 43 heures ou plus d’incubation, les colonies d’A. brasiliensis restent jaune pâle, mais commencent à produire des têtes de conidies noires qui permettent de les différencier d’une colonie d’A.flavus.

PRECAUTIONS
Les moisissures et les champignons poussant sur ce milieu peuvent produire des mycotoxines.
Par conséquent, tout en prenant les précautions d’usage pour éviter de propager l’infection, il faut manipuler les boîtes avec prudence. Agir de même avec les échantillons d’aliments contaminés.

CONSERVATION
Conserver le milieu déshydraté à 10–30°C jusqu’à la date de péremption indiquée sur le flacon.
Conserver le milieu prêt à l’emploi à 2–8°C.

ASPECT DU MILIEU
Milieu déshydraté : poudre fine, jaune paille
Milieu préparé : gélose jaune paille

CONTROLE DE QUALITE

* souches disponibles en Cultiloops

BIBLIOGRAPHIE
1   Beuchat L.R. (1984) J fD Protection 47. 512-591.
2   Pitt J., Hocking D. and Glenn D.R. (1983) J. Appl . Bact ., 54. 109-114.
3   Bothast R.J. and Fennel D.I. (1974) Mycologia 66. 365-369.
4   King D.A., Hocking A.D. and Pitt J.I. (1979) J. Appl . & Environ. Microbiol ., 37. 959-964.
5   Jarvis B. (1973) J. Appl . Bact ., 36, 723-727.